单细胞基因组测序 单细胞基因组测序是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组之后进行高通量测序，用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。全基因组测序的应用范围涉及临床医药研究、群体遗传学研究、关联分析、进化分析等众多领域。 1、实验方案 测序策略：Illumina HiSeq X PE 150 数据量：推荐30~50×测序深度 2、技术优势 （1） 多种变异检测：单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失（InDel）和结构变异（SV）； （2） 与芯片方法比较，可以检测到新的变异序列； （3）与人类全基因组从头测序相比，耗时更短、成本更低。 3、数据分析 3.1 标准信息分析 （1）按标准流程进行数据整理及数据质量评估； （2）与参考基因组比对； （3）SNP的检测及其在基因组的分布； （4）InDel的检测及其在基因组的分布； （5）CNV的检测及其在基因组的分布； （6）包含变异基因的功能注释（GO注释、Pathway注释）。 3.2 高级信息分析（肿瘤基因组学） （1）癌基因/抑癌基因/易感基因筛查； （2）高频突变基因统计及通路富集分析； （3）NMF突变特征及突变频率分析； （4）NovoDriver已知驱动基因筛选； （5）基因组变异Circos图展示。 4、技术流程 5、案例分析 案例（1） 单细胞基因组测序解构正常成人大脑的单个神经元突变 来自霍华德休斯医学研究所的（HHMI）的研究人员从三位去世的成人捐赠的健康大脑中分离出了36个神经元并测序了它们的基因组。为了进行比较，科学家们还从每个个体的心脏中分离出了细胞进行DNA测序。他们发现每个神经元的基因组都是独特的。每个神经元都有1000多个点突变，只有少数突变出现在一个以上的细胞中。尽管神经元中的大多数突变是独特的，一小部分出现在了多个细胞中。这表明了这些突变起源于脑细胞仍在分裂之时——这一过程在出生前便完成。这些早期突变随细胞分裂和迁移传递下去，科学家们能够利用它们来重建部分大脑发育史。 图1 脑中体细胞SNV位点与神经系统功能和疾病相关 案例（2） 一种新的单细胞基因组测序方法-组合索引测序 单细...
Exosome lncRNA测序 Exosome作为活细胞分泌的含有RNA和蛋白质的微囊，大小为30-100nm，广泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等多种体液中。最新研究表明，体液中 exosomal RNA （特别是miRNA、piRNA和lncRNA等非编码RNA）在不同的疾病模型中存在明显的表达差异。同时，这些分子被exosomes的脂膜所包裹和保护，能保持其原有稳定性和生物学功能，有望成为液体活检的重要分子标志物。 通过exosome lncRNA测序技术，可以开发针对复杂疾病的无创早期检测标志物；指导针对复杂疾病特别是肿瘤的个性化治疗；用于疾病的预后判断，特别是循环系统疾病和肿瘤。 华银采用全球领先的exosome RNA富集和提取技术，并结合微量RNA建库和高通量测序技术，提供exosome lncRNA研究整体解决方案，为广大的生物医学研究者提供最高质量的技术服务。 1、实验方案 测序策略：Illumina NextSeq 500 或 HiSeq 3000 PE150 数据量：推荐12G clean data 2、技术优势 （1）任意物种检测：相对传统芯片而言，无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因或基因组信息，能够直接对任何物种进行最全面的转录组分析； （2）分辨率高：可以检测转录本中单碱基的差异； （3）检测范围广：从几个到数十万个拷贝精确计数，可同时鉴定正常和稀有的转录本； （4）信息分析广：可以做基因差异表达分析、可变剪切、融合基因分析；新转录本预测及注释。 3、数据分析 3.1 标准信息分析 （1）数据过滤及质量评估 （2）核糖体RNA去除率计算 （3）比对参考基因组及统计 （4）基因表达水平分析 （5）基因表达差异及聚类分析 （6）差异基因KEGG生物通路富集分析（仅限于模式物种） （7）差异基因GO功能富集分析（仅限于模式物种） （8）已知mRNA表达量分析 （9）已知mRNA差异表达及聚类分析 （10）已知lncRNA表达量分析 （11）已知lncRNA差异表达及聚类分析 （12）预测新lncRNA （13）新lncRNA鉴定和表达量分析 （14）新lncRNA差异表达及聚类分析 （15）新lncRNA家族分析 （16）SNP和Indel检测与注释 （17）生物学重复样品间相关性分析 （18）蛋白互作网络分析 （19）基因融合 （20）主成份...
Exosome miRNA测序 Exosome是由活细胞分泌的含有 RNA 和蛋白质的微囊，大小为30-100nm。几乎所有类型的细胞都能分泌，广泛存在于各种体液中，包括血清、尿液、细胞培养上清、乳汁、唾液、腹水、羊水、气管肺泡灌洗液和关节滑液等。Exosome参与调控重要的细胞生理活动，在免疫应答、凋亡、血管生成、炎症反应、凝结过程中的作用均有报道，可以成为多种疾病的早期诊断标记物，也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。 Small RNA是一类高度保守的小RNA分子，它可以参与基因表达与调控、RNA的加工与剪切、蛋白质翻译、遗传“入侵”抑制、配子发生等重要生物学过程，是生命活动中必不可少的调控因子。小RNA测序技术采用胶分离技术，收集样本中18~30nt的RNA片段，利用高通量测序技术对样本中所有small RNA家族进行测序和表达定量，从而解析miRNA 、siRNA 、piRNA 其它非编码RNA等序列，并预测新的小RNA及其靶基因。 1、实验方案 测序策略：Illumina NextSeq 500 SE50 数据量： 推荐10M clean reads 2、技术优势 通量高：一次测序得到上千万条序列； 分辨率高：可以检测小RNA单个碱基的差异； 精准度高：从几个到几十万个拷贝精确计数； 可重复性好：深度测序保证了抽样随机性，重复性好，无需重复实验； 检测范围广：既能鉴定已知小RNA，又能发现新的小RNA。 3、数据分析 3.1 标准信息分析 （1）按标准流程进行数据整理及数据质量评估； （2）样品间的公共序列和特异序列分析； （3）小RNA与参考基因组比对分析； （4）按照优先级将小RNA进行分类注释 （5）Novel Small RNA预测； （6）样本间miRNA差异表达分析； （7）已知miRNA的家族分析； （8）已知miRNA差异分析（≥2个样本）和聚类分析（≥3个样本）； （9）已知miRNA和novel miRNA的靶基因预测； （10）已知miRNA和novel miRNA的靶基因GO注释和KEGG通路分析； （11）novel miRNA差异分析（≥2个样本）和聚类分析（≥3个样本）； （12）差异miRNA靶基因预测； （13）已知miRNA的碱基编辑分析； 3.2 高级信息分析 （1）snoRNA注释 （2）piRNA注释 （3）mir2disease注释 4、技术流程 5...
LncRNA测序 长链非编码 RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一类长度在200nt以上且不编码蛋白质的RNA，以带polyA尾和不带polyA尾两种形式广泛存在于各种生物体内，参与细胞内多种过程调控，具有跨物种的低保守性，组织特异性表达和丰度低等特点。 近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰和核内运输等多种重要的调控过程，但绝大部分lncRNA的功能目前仍不清楚。应用高通量测序技术，研究人员能够快速获得与疾病或者特定生物学过程相关的lncRNA 并进行深入研究。 1、实验方案 测序策略：Illumina NextSeq 500或HiSeq 3000 PE150 数据量：推荐12G clean data 2、技术优势 （1）任意物种检测：相对传统芯片而言，无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因或基因组信息，能够直接对任何物种进行最全面的转录组分析； （2）分辨率高：可以检测转录本中单碱基的差异； （3）检测范围广：从几个到数十万个拷贝精确计数，可同时鉴定正常和稀有的转录本； （4）信息分析广：可以做基因差异表达分析、可变剪切、融合基因分析；新转录本预测及注释。 3、 数据分析 3.1 标准信息分析 （1）数据过滤及质量评估 （2）核糖体RNA去除率计算 （3）比对参考基因组及统计 （4）基因表达水平分析 （5）基因表达差异及聚类分析 （6）差异基因KEGG生物通路富集分析（仅限于模式物种） （7）差异基因GO功能富集分析（仅限于模式物种） （8）已知mRNA表达量分析 （9）已知mRNA差异表达及聚类分析 （10）已知lncRNA表达量分析 （11）已知lncRNA差异表达及聚类分析 （12）预测新lncRNA （13）新lncRNA鉴定和表达量分析 （14）新lncRNA差异表达及聚类分析 （15）新lncRNA家族分析 （16）SNP和InDel检测与注释 （17）生物学重复样品间相关性分析 （18）蛋白互作网络分析 （19）基因融合 （20）主成份分析（PCA） （21）特征性差异表达基因分析 （22）lncRNA保守性分析 （23）可变剪切 3.2 高级分析 （1）已知mRNA-lncRNA共表达网络构建 （2）基因结构优化及优化基因的表达值计算 （3）eQTL分析 4、技...
转录组测序 转录组测序是利用第二代高通量测序技术快速获取某一物种特定器官或组织在某一状态下几乎所有转录本的序列信息，进行疾病与正常样本间的基因表达差异分析、可变剪切和融合基因分析，寻找与癌症、遗传病相关的致病基因，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。相对于传统芯片而言，无需预先设计特异性探针，具有分辨率高、检测范围广和准确率高的优点。 1、实验方案 测序策略：Illumina NextSeq 500或HiSeq 3000 PE150 数据量：推荐8G clean data，细菌和真菌视转录组大小情况而定 2、技术优势 （1）任意物种检测：相对于传统芯片而言，无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因或基因组信息，能够直接对任何物种进行最全面的转录组分析； （2）分辨率高：可以检测基因家族中相似基因及可变剪接造成的单碱基差异； （3）检测范围广：从几个到数十万个拷贝精确计数，可同时鉴定正常和稀有的转录本； （4）信息分析全面：可以做基因差异表达分析、可变剪切、融合基因分析、新转录本预测及注释。 3、信息分析 3.1 标准信息分析 （1）按标准流程进行数据整理及数据质量评估； （2）与参考序列比对，计算不同基因的RPKM值； （3）基因的差异表达分析； （4）样本间基因表达水平的相关性分析（仅限于有生物重复的样本）； （5）样本间差异基因韦恩图及PCA分析； （6）差异基因的表达模式聚类分析； （7）差异表达基因GO功能富集分析； （8）差异表达基因Pathway显著富集分析； （9）差异表达基因的蛋白质互作网络分析； （10）条件特异表达； （11）鉴定基因的可变剪切； （12）SNP/InDel分析； （13）新转录本预测及注释； （14）融合基因分析（仅限于人）； 3.2 高级信息分析： （1）基因结构优化（只针对真核生物） （2）RNA编辑 （3）差异基因的转录因子分析（适用于植物） 4、技术流程 5、案例分析 案例（1）科学家绘制细胞周期的高分辨率转录组图谱 细胞周期的推进很大程度上依赖于周期性基因表达。本研究绘制了细胞周期的高分辨率转录组图谱，揭示了周期性基因与癌症之间的新关联。研究人员在两个连续的细胞周期中对人类细胞进行RNA测序...
外显子组测序 外显子组测序是指利用高效的序列捕获技术将基因组中的外显子区域捕获后进行高通量测序的方法。在人类基因中大约有180,000个外显子，虽然外显子组仅占人类基因组的1%（约30MB），但是约85%的致病突变发生在外显子组区域。外显子组测序主要用于识别和研究与疾病、种群进化相关的编码区及UTR区域内的结构变异。结合大量的公共数据库提供的外显子数据，能够更好地解释所得变异结构之间的关联和致病机理。相比传统方法，外显子组测序能够更经济高效的检测外显子区域的变异情况，以此来为临床诊断和个体化用药服务。外显子组测序目前已被广泛的应用于各种癌症、单基因病、复杂疾病和罕见遗传病等研究中。 1、实验方案 捕获平台：Agilent SureSelect Human All Exon V6（最新捕获试剂盒） 测序策略：Illumina NextSeq 500或HiSeq 3000 PE150 数据量：推荐100×以上的深度测序，约10G clean data 2、技术优势 （1）高覆盖度：同等费用下获得更高深度测序，SNP检出率99%； （2）更高通量：适合大样本量的研究； （3）经济高效：相比于全基因组重测序，更加经济、高效； （4）周期短：加快文章发表与加速临床应用。 3、数据分析 3.1 标准信息分析 （1）按标准流程进行数据整理及数据质量评估； （2）与参考序列进行比对、统计测序深度及覆盖度； （3）SNP和InDel变异信息检测； （4）SNP和InDel变异所在基因的功能注释（GO、Pathway）； （5）CNV检测和注释分析； （6）变异基因保守性预测及致病性分析（SIFT、Polyphen-2、GERP）； 3.2 高级信息分析 （1）癌基因/抑癌基因/易感基因筛查； （2）高频突变基因统计及通路富集分析； （3）NMF突变特征及突变频率分析； （4）已知驱动基因筛选； （5）基因组变异Circos图展示。 4、捕获平台介绍 Agilent SureSelect Human All Exon V5 特点如下： （1） 捕获范围为50Mb，包括21,522条基因的357,999个外显子区域； （2） 根据CCDS、RefSeq、GENECODE、miRNABase、TCGA及UCSC数据库设计探针，可有效获得外显子区及其周边区域的变异信息。 （3）周期短，仅需1.5天，测序样品便可准备就绪。 5、技术流程 6、案例分析 ...
全基因组重测序 目前人类已知的疾病中，有4000多种疾病与人类的基因有关。利用全基因组重测序的方法，可以在全基因组水平上检测与疾病相关的突变位点、结构变异等信息，进而找寻攻克这些疾病的治疗手段，研发有效地治疗药物。全基因组测序的应用范围涉及临床医药研究、群体遗传学研究、关联分析、进化分析等众多领域。 1、实验方案 测序策略： illumina HiSeq X PE150 数据量：推荐肿瘤50×测序深度/对照癌旁、血液30×测序深度；遗传病30~50×测序深度。 2、技术优势 （1）多种变异检测：单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失（InDel）和结构变异（SV）； （2）与芯片方法相比，可以检测到新的变异序列； （3）与人类全基因组从头测序相比，耗时更短、成本更低。 3、数据分析 3.1 标准信息分析 （1）按标准流程进行数据整理及数据质量评估； （2）与参考基因组比对； （3）SNP的检测及其在基因组的分布； （4）InDel的检测及其在基因组的分布； （5）CNV的检测及其在基因组的分布； （6）包含变异基因的功能注释（GO注释、Pathway注释）。 3.2 高级信息分析（肿瘤基因组学） （1）癌基因/抑癌基因/易感基因筛查； （2）高频突变基因统计及通路富集分析； （3）NMF突变特征及突变频率分析； （4）已知驱动基因筛选； （5）基因组变异Circos图展示。 4、技术流程 5、案例分析 案例（1）胰腺神经内分泌肿瘤的全基因组图谱 胰腺神经内分泌肿瘤（PanNETs）是第二大胰腺上皮细胞肿瘤，致死率达60%。随着检测手段越来越灵敏，胰腺神经内分泌肿瘤诊断数量呈现上升趋势，这给临床诊疗带来了一定的挑战！在一项新的研究中，研究人员揭示出正常情形下与乳腺癌、卵巢癌和结肠癌相关联的基因变异同样能够促进一种罕见的胰腺癌产生。EWSR1与BEND2发生体细胞融合，确定BEND2为EWSR1的一个新融合基因。发生体细胞融合的患者，其细胞形态和免疫组化特征具有典型的胰腺神经内分泌肿瘤特征。通过RNA-seq和RT–PCR确认了EWSR1和FLI1发生体细胞融合。 图1 胰腺神经内分泌肿瘤中的突变特征 案例（2）全基因组测序确定EN1作为骨密度和骨折的决定因素 本研...
细菌基因组测序/小基因组测序(10K~1M的DNA序列) 随着新一代测序技术的迅猛发展，全基因组测序已经成为细菌基因组研究不可或缺的重要工具。新一代高通量测序技术大大降低了细菌基因组研究成本，缩短了研究周期，为实验室的细菌基因组研究提供了便利。 细菌不但个体微小，其基因组也比动植物小得多，一般在10M以内。微生物基因组测序能够检测微生物全基因组的核苷酸变异，通过全基因组测序，研究人员可以找到大量的单核苷酸多态性位点(SNP)、拷贝数变异(CNV)、插入缺失(InDel)、结构变异(SV)等变异信息，应用范围涉及临床医药研究、微生物致病性研究、物种进化分析等领域。 1、实验方案 测序策略：Illumina MiSeq PE250/PE300 数据量：推荐测100×以上 2、数据分析 2.1 标准信息分析 （1）按标准流程进行数据整理及数据质量评估 （2）K-mer分析以及基因组大小估计 （3）序列组装 （4）组装基因组的深度和覆盖度分析 （5）组装结果的核酸库比对分析 （6）基因预测 （7）基因功能注释(GO-COG/KOG) （8）基因生物通路注释(KEGG) 2.2 高级信息分析 （1）基因组详细信息环形图 （2）共线性分析 （3）基因家族分析 （4）CRISPR预测 （5）基因岛预测（毒力岛） （6）前噬菌体预测 （7）分泌蛋白预测 （8）动植物病原菌致病性分析等 3、技术流程 4、案例分析 案例（1）高通量测序分析发现新细菌 德国微生物学与细胞培养研究所微生物系最近从咸水环境微生物垫的低氧过渡区中分离培养获得了一种中度嗜盐，专性厌氧，分解糖类的细菌，并编码代号为L12-Fru-ABT。利用16s测序分析后发现该微生物应该代表着一个新的种属，研究发现该菌在各种缺/微氧环境中都广泛存在，比如咸水环境，沸水和动物肠道；随后，研究人员利用全基因组测序方法对该菌进行基因组序列分析，结合该菌的表型，推断出L12-Fru-ABT该菌及其相关细菌是能够专门适应和利用微生物垫或生物膜产生的硫酸化的甘油聚合物。 图1 基于16s rRNA基因测序的L21-Fru-ABT在发育树的位置图 图2 K.glycovorans L21-Fru-ABT和几个PVC superphylum的代表性细菌的基因组系统发育构成成分 案例...
免疫组库测序（华银特色服务项目） 免疫组库（Immune Repertoire，IR）是指某个个体在任何特定时间点其循环系统中所有功能多样性B淋巴细胞和T淋巴细胞的总和。T细胞和B细胞分别介导机体的细胞免疫和体液免疫应答，分别通过其表面的T细胞受体（TCR）和 B细胞受体（BCR）来识别和结合抗原，进而发挥功能清除病原体或体内肿瘤细胞。 免疫组库高通量测序是通过多重PCR或SMART RACE法扩增TCR/BCR全长或CDR3区序列（主要是TCR的β链或BCR的重链），再结合高通量测序技术，对机体免疫组库的多样性及每种 T、B细胞克隆的独特性序列组成和变化进行分析，从而全面评估机体的免疫状态，明确疾病与T、B细胞克隆组成及变化之间的关系。随着免疫组库高通量测序技术的不断发展和成熟，基于免疫组库多样性变化特点的生物标志物发现、肿瘤等疾病疗效预测、疾病的易感性和抵抗性、感染性疾病及疫苗研究等方面都取得了重要进展。 1、实验方案 测序平台： Illumina MiSeq PE300 或 NextSeq 500 PE150 2、样本要求 （1）分选的T或B细胞：建议细胞数103-107个，离心后保存于1ml Trizol中并混匀，低温保存运输。 （2）外周血单个核细胞（PBMC）：建议细胞数103~107个，离心后保存于1ml Trizol中并混匀，低温保存运输。 （3）新鲜全血：采集外周血于EDTA抗凝管内，混匀后取 250μl，保存于750μl Trizol LS并混匀，低温保存运输。 （4）组织：取50~100mg组织，保存于1ml Trizol中，低温保存运输。 （5） 如果客户自提 RNA，建议最好用进口试剂或试剂盒提取，最后溶于无RNA酶的水中。如果是分离的PBMC，RNA浓度大于50ng/μL，总量大于500ng。如果用组织提 RNA，浓度＞500ng/μL，总量＞5μg。 3、技术优势 （1）用免疫组库扩增最可靠的SMART RACE法，保证结果的可靠性和后期研究的方便性； （2）用最优选最可靠的扩增和建库试剂，保证组库序列扩增的保真性和扩增效率； （3）由武汉大学、中山大学、南方医科大学以及美国斯坦福大学研究人员组成的专业的研究和分析团队，保证研究结果的可信度和可重复性； （4）针对不同样品类型（细胞、组织、全血），不同浓度梯度细胞数（100个以上淋巴细胞）均可建库测序； （5）运用国际认可的专业的免疫组库分析模块，并结合我们自己独有的生物信息分析算法，所提供的标准...
