精子超微形态学分析——更高级的精子形态学检查
2023-02-21 阅读数：4363
精子超微形态学分析项目是广州华银医学检验中心联合南方医科大学和西安交通大学共同打造的针对男性精子结构异常的超微形态学检查服务，可对临床OAT综合症的男性患者进行深入检查，对结构异常精子进行明确观察及分析，减少患者的尝试性治疗并指导相关临床干预方案的判定，还可在治疗过程中提供预后疗效评价，在临床诊疗分析与学术建设方面均有着非常重要的意义。
背景
男性不育问题日益严重
近年来，男性不育情况日益加重，影响男性不育的因素和病症繁多，WHO调研显示，不育症男性患者经诊断，其中48.5%为不明原因导致，其他原因包括特发性精液异常、精索静脉曲张、泌尿系统感染等[1]。通常情况下，不论由何种原因引起的男性不育，都一定会伴随男性精液中精子浓度(Concentration)、活动性(Motility) 、形态(Morphology)的异常[2]，相对应男性少精症(Oligospermia)、弱精症(Asthenospermia)、畸精症(Teratospermia)，即OAT Syndrome[3]。因此，精液质量是目前衡量男性生殖能力的决定性指标[4]，临床检查中也以此作为男性生育能力的主要依据。男性生殖领域中，传统的精液质量检查手段有精液常规检查（PRT）、抗精子抗体（AsAb）检查和精子DNA碎片检查（DFI）等，其中PRT适用范围最广。但由于PRT所使用的光学显微镜放大倍数不高，导致无法观察到精子的微小细胞器结构[5]，不足以满足临床诊断需求，因此需要更加深入细致的精液质量评估，来确定患者的不育症是否可逆。众多行业内期刊开始强调精液超微结构检测在男性精子异常临床诊断中的应用，认为超微结构有利于明确精子异常的具体原因[6]。
精子超微形态学分析是针对男性精子结构异常的超微形态学检查服务，基于普通透射电子显微技术，对精子的超微形态进行描述，主要分为顶体、细胞核、颈部、中段、主段、末段六个部位，并给出最终的超微形态学分析解释及建议。在实验流程方面，精液标本经固定、离心、脱水后，通过甲苯胺蓝染色定位，选择精子较为集中的位置进行三重超薄切片，3*2观察深度下捞出6片铜网进行观察，能达到至少150个精子的有效检查数量，使得最终的分析结果更加全面。
临床
意义
对结构异常精子进行明确观察及分析
（1）为原发性纤毛运动障碍（PCD）和尾部多发形态异常（MMAF）提供重要依据[7,8,9]
MMAF 是一种特殊类型的弱、畸形精子症，表现为精子鞭毛的多种形态异常，如鞭毛缺失、弯曲、卷曲、短小或口径不规则。PCD是一种基因遗传性疾病，包括不动纤毛综合征，纤毛运动方向缺陷等等，由于大量基因突变导致纤毛功能异常引起了一系列临床表现。二者均与动力蛋白微管“9 + 2”排列有关的超微结构异常有关，如缺乏中央微管对、轴丝紊乱、纤维鞘和线粒体鞘异常等，进而影响精子的运动能力，导致男性不育，甚至在成功受孕后也会有遗传给下一代的风险[10]。
精子的尾巴可分为三个部分：中部、主部分和末端部分。外致密纤维（ODFs）沿着中间和主要部分运行，线粒体（MS，线粒体鞘）围绕着中间的odf。在主体部分中，ODFs 3和8被转移肋（TR）取代，并形成纤维鞘（FS）的一部分?；肥侵屑淇楹椭骺橹涞睦┥⑵琳希游膊客ü肺柴詈献爸茫℉TCA）与头部相连。轴突沿着整个尾巴运行，在精子鞭毛和运动纤毛中显得超微结构相同，包含9个外双微管（OD）和一个中心对（CP）。径向辐条（RD）将OD连接到CP，连接件连接相邻的OD。头尾偶联装置（HTCA）将精子的尾巴连接到头部，并由中心粒附着到细胞核上形成?；肥侵屑洳糠趾椭鞑糠种涞睦┥⑵琳稀?sup style="font-size:12px;box-sizing:border-box;">[10]
（2）明确大、圆、无头精子症的超微形态学分析
大、圆、无头精子症起因于精子的头部、颈部及中段发育异常，通常伴随着精子细胞核发育不良[11]、染色质异常凝聚、DNA损伤、顶体发育过度或不完全、中心粒未能正确发育等原因，最终表现为精子头部异常不规则增大（Macrozoospermia）、不定形圆头（Globozoospermia）以及大头针样断头、短尾精子（ASS）。此类疾病患者在精液常规检查参数较为多样化，较难与常规OAT患者区分，因此通过超微形态学分析，可以更好的提供相关依据，从而明确患者后续的遗传学检查手段[12,13,14]。
正常头部精子
大头精子
正常头部精子和大头精子电镜图( 透射电镜图×10 000)[15]
(a) 光学显微镜 (c)透射电子显微镜（TEM）[11]
（3）ART治疗获益性评估
据临床反馈，部分OAT综合征男性患者在接受ART治疗后出现效果不好或反复失败的情况，主要原因可能是精子形态异常、染色体异常导致。部分临床研究表明，精子的顶体缺失[16]和尾部异常[17]会显著降低患者的IVF-ET治疗受精率，精子核的形态异常、染色质凝聚异常[18]和DNA损伤等情况也会明显降低ICSI的受精成功率和妊娠成功率（见下图）。因此建议有生育要求的患者可以在接受IVF-ET或 ICSI之前进行精液的超微形态学分析，通过观察精子活力、形态等各项指标进行初步评估和筛查。
(a)具有形态正常细胞核的精子对ICSI受精率的预测值。(b)细胞核形态正常的精子对ICSI后实现妊娠的预测价值。（ROC曲线下面积74%；截断值28.5%；最佳敏感性 68%；最佳特异性67%；）[18]
应用
价值
协助临床发现不育症根本病因，减少患者的尝试性治疗，提供疗效评价依据
（1）精子活动性弱的超微形态学查因；精子畸形的深度评估，鉴别光镜下的“假性正常精子”
目前临床上对于精子形态的判断，主要依赖于光镜的精子形态学分析。但是，光镜由于放大倍数、染色技术等条件限制，导致无法对于精子的细微结构进行评估。因此，对于精子畸形率高的患者，在患者生育潜力的评价方面，有一定的局限性。利用普通透射电镜的超微形态学分析，可以协助鉴别光镜下的“假性正常精子”，更加准确的评估精子结构，从而客观评价患者的生育潜力，及时做出有效的临床策略。
（2）协助发现正常精液长期不育的病因，全面评估正常精液长期不育患者的精子超微结构[19,20]
根据临床不完全统计，精液常规检查正常的人群中，大约存在10%不育的男性患者。虽然常规检查正常的精液无法成功受精的原因还不明确，但是普通透射电镜可以作为一个深度评估精子质量的优质工具，对于精液正常但长期不育的男性患者，提供更加精细化的超微病例诊断依据，协助发现诸如顶体折叠、中心粒异常、染色质发育异常等多种超微结构因素[17]，协助临床对于患者精子质量做出正确判断。
精子的纵向和横切面的透射电镜显微图。在体外受精不成功的男性中发现的最常见的病理的例子。A）三头畸形；B）精核明显颗粒状改变；C)头部基本正常，颈部胞浆残留过多；D）顶体不完整，呈波浪状，顶体下间隙增大，顶体出现空泡，可见较大核泡。
（3）为可逆性精子缺陷的患者提供疗效评价及治疗方案依据
WHO男性不育标准化与诊疗手册指导，对男性不育患者的治疗目的主要是试图改善其精液质量，在选择治疗策略时，应遵循“降级原则”，采用达到妊娠的治疗方法，从较复杂昂贵和损伤性方法降为使用损伤较小的技术。这些技术可以降低女性伴侣及子代的治疗风险，降低夫妇及社会的治疗成本。而常用的治疗方法大多是采用一定的中西药干预治疗，许多学者会对实施治疗方案的精子进行精液常规检查和TEM检测，观察治疗前后的精子浓度、活力及形态学变化[21,22]，对不同治疗方案进行疗效评价及方法优化。
(a)针刺治疗前精液的结构特征。精子通常表现为畸形的细胞核(N)和顶体(A)，带有未浓缩、坏死或边缘的染色质、细胞质残基（CR）和卷曲的轴突（箭头）。放大率8000。(b)针刺治疗后精液的结构特征。精液中含有精子，其特征是具有形状规则的顶体(A)和细胞核(N)，染色质浓缩良好，具有规则组装的线粒体(M)和正常的细胞骨架结构（AX）。一些精子显示出顶体和细胞核的改变，染色质不浓缩。放大13,500倍。[22]
# 小 结 #
精子超微形态学分析项目是广州华银医学检验中心联合南方医科大学和西安交通大学共同打造的针对男性精子结构异常的超微形态学检查服务，可对临床OTA综合症的男性患者进行深入检查，对结构异常精子进行明确观察及分析，明确其病因，协助临床发现不育症的根本病因，减少患者的尝试性治疗并指导相关临床干预方案的判定，还可在治疗过程中提供预后疗效评价，在临床诊疗分析与学术建设方面均有着非常重要的意义。本项目具有以下四大突出优势：
1. 人员优势
团队成员多年来专注于超微病理分析与诊断领域，学科带头人在国内外均具有丰富的男科超微诊断经验。本项目由中华医学会男科学分会主任委员、中山大学附一院主任男科邓春华教授担任首席临床顾问，国内知名生殖病理专家、西安交通大学病理系主任周党侠教授担任领衔专家。在两位教授带领下，华银康精子超微形态学分析项目将按照国际标准，采用优化的标本处理流程，制定规范化的精子超微形态学分析报告系统，为精液质量检查提供更为深入、直观、精准的分析。
2. 技术优势
2.1 改良版标本保存方法
多数文献报道的精液电镜标本保存方法为取材后静置待精液完全液化，随后用离心机离心取精子沉渣，加入固定液固定后再置备观察。该方法需要临床具备离心机等器材，且操作较为繁琐，不利于临床取样的便捷性。本中心改良后的精液电镜标本保存方法操作简便，极大简化送检流程。
2.2 最新微波处理技术提高实验效率
在精液电镜标本的制样脱水过程中，传统方法需要处理8h左右才能完成脱水过程，而本平台拥有的KOS Microwave Histostation仪器，采用国际最新微波处理技术，可将制样脱水过程缩短至2.5h，大大节省时间成本，提高整体实验效率。
2.3 3*2观察深度下，分析结果更为全面
对比传统标本切片方式，经包埋后的标本切一个横截面进行取材，每次只能观察20-50个精子，本项目采用的方式是一个树脂块进行三重切片，每重切片通过定位捞取两片铜网，总共得到6个铜网的观察范围，理论上可观察到150个精子，观察数量为传统方法的三倍，极大减少误诊漏诊率，使分析结果更为全面准确。
3. 报告快捷优势
工作室会按照每天10个病例1个医生，1.5个技术人员来配备，能让每个技术人员能更细心处理每个标本，每个医生在发报告时能有时间更好的和临床沟通。承诺标本到达后5-7个工作日内能出具报告。
4. 增值服务优势
本中心会为每一个送检医院建立微信群，群里包括临床医生、病理医生及客户专员等。在这个微信群里病理医生可为临床医生提供更为及时的沟通交流，对报告结果进行解读，对临床医生提出的问题与建议及时反馈、沟通，有效的节约了时间。在整理好报告后我们会第一时间将报告内容发在微信群中，便于医生早些知道患者的结果。对于有需要的医生，我们还可以在微信群中提供所有的电镜采图及一些科研服务指导，临床医生可以方便的看到患者的病理切片全部采图情况。一起分享，一起成长。
