16S+代谢组学联用常见问题一揽子告诉你答案
2023-01-12 阅读数：5236
微生物16S分析鉴定了样本中微生物的种类和可能具有的功能，但是微生物真的有这样的功能吗？怎么能快速准确地做出鉴定呢？那就来试试16S+代谢组学联用的方法吧。
组学联用，一个鉴定微生物种类，一个鉴定微生物功能，还能发高分文章，why not？
1、16S是什么？
16S rDNA是指细菌基因组中编码核糖体16S rRNA分子所对应的DNA序列，序列全长约1540bp，包含10个保守区和9个高变区（V1-V9）。保守区序列在细菌间差异不大而高变区则具有种属特异性，因此最常用作细菌分类标准。通过对环境样品的细菌总DNA进行提取，扩增其中16S rDNA基因，可以鉴定出绝大多数细菌类别。
2、代谢组学是什么？
代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的新兴的组学技术，是系统生物学的组成部分。其对生物体内所有小分子代谢物进行定性定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，其研究对象大都是分子量1500以内的小分子物质。
3、为什么要选择做16S+代谢组学？
16S只是研究了肠道微生物的构成和组份的改变与宿主的生理以及人类的疾病相关。然而，肠道微生物对宿主的作用其中一方面贡献是通过肠道中微生物产生的小分子次级代谢产物，通过循环系统来作用于人体的各个部位，调控宿主体内的稳态，比如许多研究发现，肠道微生物的代谢产物对糖尿病、高血压、心脏病和抑郁、肠道的免疫等疾病都有影响。16S可以得到样本当中有哪些微生物，和预测他们的功能，而代谢组学研究代谢物的表达量、代谢物与生理病理变化的关系，能够帮助确定这些功能是否真的发生了，发生的程度是什么样的。两者的联用，可以通过代谢组结果的检测辅助和验证16S分析结果；两者的联合分析可以得到微生物多样性、种类、相对丰度与代谢物丰度的关联。
4、代谢组学与其他组学相比，有什么优势？
①基因和蛋白质表达的微小变化会在代谢物水平得到放大；
②代谢组学的研究不需进行全基因组测序及建立大量表达序列标签的数据库；
③代谢物种类远少于基因和蛋白的数目，每个生物体中代谢产物大约在103数量级，而最小的细菌，其基因组中也有几千个基因；
④生物体液的代谢物分析可反映机体系统的生理和病理状态。
5、与16S联用时，如何选择是用非靶标代谢组还是高通量靶标代谢组？
如果没有特别关注的代谢物质建议选择非靶标，可以检测出某一特定条件下所有的代谢产物，并进行定性和相对定量分析，以寻找目标差异代谢物；如果有关注的目标代谢物建议选择高通量靶标代谢组，对特定的代谢物群进行有针对性的特异性检测。
6、16S 与代谢组联用时，一般检测哪些样品类型？样本量需要多少？
代谢组与16S联用时，16S的样品主要是粪便和肠道内容物；而代谢组的样本主要是粪便、血浆或血清、尿液等（具体项目可以参考相应的参考文献）。
临床标本：每组100例（不少于30例，越多越好）
模式动物：每组12个样品（不少于8个，越多越好）
注意：遵从“保持最鲜活的状态”原则，通过低温、淬灭的方法阻止离体后的代谢活动。样品不能pooling，不能反复冻融；血清/血浆不能溶血；如果是用血浆，请用肝素钠抗凝，EDTA抗凝效果不好。
7、代谢组为什么需要这么多生物学重复？
相较于基因和蛋白，代谢物处于生命活动的下游，动态波动性大。因此需要很多生物学重复来增加数据的可靠性和说服力。
8、代谢组和16S的样品取样时间可以不一致？
建议取样时间一致。
若代谢组和16S样本类型一样，那么在收集样品的时候可以多准备一份样品，即一个样分装至少2两管，一管用于16S，一管用于代谢组。
若代谢组和16S样本类型不一样，也应该要保持一样的取样时间。
9、同一样本的代谢组为什么不能分两批检测？
最好不要分成两批检测，因为这两个时间点仪器的响应会发生变化，这样可能导致的问题是一些含量低的物质可能只在一个批次里被检出。
10、代谢组学我该选择哪个平台？
代谢组学的技术平台主要分为NMR（核磁共振谱）、GC-MS（气相色谱-质谱联用）、LC-MS（液相色谱-质谱联用）。
NMR的特点是样品需求量小，前处理比较简单，对于复杂的生物样本比较合适；但对读谱人员的要求高；灵敏度低，检测动态范围有限。
GC-MS和LC-MS的特点是结合了色谱良好的分离能力和质谱的普适性、高灵敏度以及专一性，具体而言GC-MS分辨率、选择性好，数据库较为健全，但样品处理过程繁琐；LC-MS灵敏度、分辨率高，可以分析不稳定、不易衍生化、难挥发和分子量大的代谢物，可对极性化合物有较好的检测。但数据库不健全，可鉴定的化合物有限。
因此在选择平台时应结合自身样本情况与个体需求，综合考虑。
11、色谱质谱串联的优势是什么？
使用灵敏度更高、分辨率更高、定性能力更强的质谱仪代替了光学检测器。将色谱的分离能力和质谱的分辨、定性能力强强联合，可以对更多的物质进行准确检测。
12、与16S联用时，代谢组检测平台一般选择GC-MS，还是LC-MS？
两种平台都可以，因为检测平台是依据检测的代谢物类型来推荐的，具体参考如下图：
13、能区分哪一个是寄主的代谢产物，哪个是哪种微生物的代谢产物吗？
通过肠道菌群非靶向代谢组学的自建数据库，筛选出代谢物是微生物特有的，哪些是共有的，哪些是宿主的。
注：1166个肠道菌群特有的代谢物（其中884个有MS2谱图），868个人菌共有的代谢物，366个人特有的代谢物，合计共2400个。
14、做了代谢组学发现没有差异，该怎么办？
如果没有找到差异代谢物，那么还可以就检测到的物质进行KEGG Patheway分析，即对代谢物参与的代谢通路进行研究，观察是否有其他的补给途径、代谢途径与疾病之间是否存在一定的关联性。
15、代谢组检测结果的物质名称都是英文的，我需要中文名称怎么办？
建议根据物质的KEGG名称和CAS号在“爱化学”（http://www.ichemistry.cn/）网站查询中文名称。
16、如何对差异代谢物做进一步的筛选？
一般是使用 P值<0.05 & VIP>1这样的卡值来进行差异物的筛选。
P值来源单元变量统计分析，VIP值来源于多元变量统计分析（来源于 OPLS-DA模型）表征该变量对两组差异的贡献值，当然VIP值越大对差异贡献越大。
使用P值<0.05 & (FC>2或FC<0.5) [FC= Fold change]来进行差异物筛选也是有这样的做法，但是P值和FC值都来源单元变量统计分析。推荐使用P值<0.05 & VIP>1的筛选方法。
在此基础上要做进一步的筛选的话，有以下几个方法：
1）P 值<0.05，对VIP值做排序（VIP值越大，差异代谢物越有意义）
2）VIP>1，对 P值做排序（P值越小，差异代谢物越有意义）
3）在 P 值<0.05 & VIP>1 的范围内，对FC值做排序（大于2的FC，越大越有意义；小于0.5的FC，越小越有意义）
限定更严格的基础筛选条件，比如：P值<0.01 & VIP>2。重做以上三种方法。
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