T淋巴细胞（T cell）和B淋巴细胞（B cell）主要负责适应性免疫应答，其抗原识别主要依赖于T细胞受体（T cell receptor, TCR）和B细胞受体（B cell receptor, BCR），这两类细胞表面分子的共同特点是其多样性，可以识别多种多样的抗原分子。BCR的重链和TCR β链由V、D、J、C四个基因片段组成，BCR IGL链和TCR α链由V、J、C三个基因片段组成，这些基因片段在遗传过程中发生重组、重排，组合成不同的形式，保证了受体多样性。
传统免疫组库研究方式局限性较大，10x Genomics新推出的“单细胞免疫谱分析”利用其微流控芯片制备单细胞体系，选择5’ 端接头的通用引物和免疫分子恒定区的巢式引物进行V(D)J富集，实现在单细胞水平，对成对的重链和轻链（B细胞）或α和β链（T细胞）进行全长测序，为免疫组库全面、系统的研究提供了高效的技术平台，对疾病发生、发展的分子机制研究有重要的意义。
图1. 10x Genomics单细胞系统
1 技术原理
10x Genomics单细胞免疫组库测序是建立在GemCode技术上的微流体平台，将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中；接下来在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生用于测序带条形码的cDNA。液体油层破坏后，cDNA一分为二，后续同时进行基因表达和免疫组库文库构建；其中TCR或者BCR的V(D)J序列通过设计在TCR或者BCR的C区域的巢式PCR引物进行富集。然后使用Illumina测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据，实现在单细胞水平同时对基因表达和免疫组库的研究。
图2. BCR测序技术流程[1]
2 样本要求
◆ 样品类型：新鲜人或小鼠细胞悬液、血液（全血、PBMC等）；
◆ 细胞来源：血液提取、磁珠富集、流式分选、组织解离；
◆ 细胞大小：小于40μm；
◆ 细胞总量：细胞悬液，一个样本细胞起始量约1x105个；
◆ 质量要求：细胞活性大于85%，理想浓度为1000个/μl（500~2000个/μl）；
◆ 细胞培养基及缓冲液不能含有Ca2+和Mg2+等影响酶活性的物质。
3 实验流程
利用10x Genomics平台完成单细胞的分离、反转录成cDNA后，选择不同的研究目的进行文库构建：5’ 基因表达文库、TCR的V(D)J文库或和BCR的V(D)J文库。将cDNA分成2份或3份同时进行TCR/BCR的V(D)J富集、文库构建、测序和5’ 单细胞转录组文库构建、测序，获得每个细胞表达谱和V(D)J全长序列，获得数据进行细胞亚群聚类、细胞表达特征和标记分子筛选等分析。
图3. 实验流程
表1. 5’ 单细胞表达谱和V(D)J免疫组文库及测序参数
4 分析内容
测序数据质量控制；
比对与注释：样本基本信息结果统计，样本contig注释信息结果统计，样本Consensus序列注释信息结果统计；
Clonotype分型；
特征分析：CDR3特征分析，V/J基因特征分析，V-J Paired特征分析；
多样本分析：样本间Clonotype比较，Overlapping Clonotype聚类分析，Overlapping Clonotype差异分析。
5结果展示
图4. 组 Case VGene 核酸长度分布图 图5. 组 Case VGene 氨基酸长度分布图
（左图横坐标为VGENE碱基序列长度，右图横坐标为VGENE氨基酸序列长度，纵坐标为clonotype的频率，不同颜色表示不同clonotype，彩色表示top10 clonotype，灰色表示除top 10以外的其他clonotype。）
图6. 样品 TCR_Sample_1 链TRA_TRB V-J paired频率Circos图
（V-J paire频率Circos图，最外圈弧形表示V、J基因，每个颜色块代表一种基因，基因频率越高，色块越宽；内部色块间连接弧线表示V-J paired。）
5 技术优势
可实现配对的重链和轻链（B细胞）或α和β链（T细胞）的全长测序；
精确到单细胞水平，能获得大量单细胞的免疫组数据；
大规模单细胞VDJ表达谱测序，单个细胞成本大大降低；
同时获得5’ gene expression的单细胞转录组数据，可与免疫组数据联合分析
6 案例分享
Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment
发文期刊：Cell
影响因子： 30.41
了解肿瘤微环境中免疫细胞的表型，对于癌症进展和免疫治疗反应的研究至关重要。研究者使用单细胞RNA测序分析了来自8位原发性乳腺癌患者的45,000个免疫细胞，同时也添加了正常乳腺组织、血液和淋巴结中的免疫细胞作对照。研究者开发了预处理流程SeQC和贝叶斯聚类和归一化方法Biscuit，用来解决单细胞数据固有的计算难题。研究中观察到正常免疫细胞与肿瘤组织中免疫细胞之间有显著相似性，但后者针对肿瘤微环境出现特异性连续表型扩展。对来自另外27,000个T细胞的成对单细胞RNA和T细胞受体（TCR）测序，结果揭示了TCR组合使用对表型多样性的影响。研究结果支持T细胞连续活化模型，但不符合癌症中的巨噬细胞极化模型[2]。本研究结果对表征肿瘤浸润免疫细胞具有重要意义。
图7 分析路程图
参考文献：
1. Yaari, G. and S.H. Kleinstein, Practical guidelines for B-cell receptor repertoire sequencing analysis. Genome medicine, 2015. 7(1): p. 1-14.
2. Azizi, E., et al., Single-cell map of diverse immune phenotypes in the breast tumor microenvironment. Cell, 2018. 174(5): p. 1293-1308. e36.
