传统的高通量测序是对某一组织整体的细胞合集进行测序和分析，而某一个细胞的基因信息则会被整体覆盖。随着高通量测序技术的发展，人们对基因组与表型之间的关系认识越来越深刻，单个细胞也有可能携带重要的信息。
10x单细胞测序是使用10x Genomics平台，将单细胞悬液中的每个细胞分别进行标记，再通过逆转录和PCR建库测序，分析单个细胞的转录组信息。单细胞测序可以揭示复杂细胞群体的异质性，避免单个细胞的基因表达信号被群体的平均化所掩盖。
1、10x单细胞转录组测序实验方案
测序策略：Illumina平台PE150
数据量与捕获的细胞数量相关，捕获细胞越多，产生的数据量也越多，具体如下：
2、单细胞转录组测序技术优势
（1）精准分选：利用10x Genomics平台，实现真正的单细胞测序；
（2）细胞捕获率高达65%，可实现大量单细胞的快速高效标记、测序和分析；
（3）项目周期短，技术应用范围广。
3、送样建议
细胞样本
联系我们上门服务（提前10个工作日预约）。
血液样本
抽取5ml人外周血加入到EDTA抗凝管中，分离PBMC后，联系我们上门服务（提前10个工作日预约）。
组织样本
方案一：取新鲜组织进行组织解离后，制备为细胞悬液，联系我们上门服务（提前10个工作日预约）；
方案二：新鲜组织取黄豆大小（1-2mm3）剪碎后置于保存液（公司提供）中，48h内冰袋运输到我司。每个样本至少准备两管，一管作为备份。
注意事项：冰袋若从-80℃拿出，需放4℃冰箱2h。
4、技术流程
5、单细胞转录组测序信息分析
1测序数据质控和定量
1.1测序序列统计与质控
1.2数据定量
1.3多样本数据合并和定量均一化
1.4最终鉴定细胞表达量矩阵
2细胞亚群分类
2.1细胞过滤
2.2单细胞亚群分类
3 Marker基因分析
4差异富集分析
4.1差异基因GO富集性分析
4.2差异基因KEGG富集性分析
5高级分析
5.1已知基因在细胞亚群表达分布及热图
5.2细胞分化拟时序分析
5.3细胞相互作用图谱
5.4加权基因共表达（WGCNA）分析
5.5蛋白质互作网络分析
5.6细胞周期鉴定
6、结果展示
图1 PCA基因热图
图2 单细胞亚群分类tSNE图
图3 拟时序轨迹图
（拟时序分析（pseudotime），即构建细胞谱系发育，主要是判断不同细胞表达量之间的关系，不同亚群之间表达量过渡的变化就是一条轨迹，这个时间并不是真的时间，而是一个虚拟的时序列，是指细胞与细胞之间的转化和演替的顺序和轨迹。Monocle是我们经常用的拟时序分析工具，通过R语言读取seurat对象后可进行数据分析，基于某些Marker基因表达模式，进而描绘细胞在随时间发育过程的动态变化。）
图4 拟时序变化相关基因（Top10\ Top50）表达分布图\热图
7、单细胞转录组测序案例分析
Nature Immunology狼疮性肾炎患者的肾脏免疫细胞组成单细胞测序分析
图5 细胞亚型聚类图
通过对LN患者和健康个体的肾脏、血液和尿液样本进行单细胞转录组测序分析，结果显示，血液与肾脏中检测到的细胞分子特征存在相似性和差异性，而尿液与肾脏中白细胞亚群的分子活化状态高度相关，有望作为肾脏活检的代替物。
使用低分辨率聚类将所取肾脏细胞分为了10个集群，基于谱系标记基因和其他基因上调，将集群标记为髓细胞（C4, C6）、T/NK细胞（C0, C1, C2, C5）、B细胞（C3, C8）、分裂细胞（C9）和肾上皮细胞（C7）。接下来，将每个谱系的细胞分别进行聚类，一共确定了21个免疫细胞集群和一个上皮细胞集群（图2）。
研究利用单细胞转录组学研究从LN患者和活体供体对照中获得的肾脏样本，揭示了LN肾脏免疫群体的复杂性，识别了髓细胞、NK细胞、T细胞和B细胞等多种疾病特异性亚群。研究发现：大量的分裂细胞和NK细胞，表明IFNγ和细胞溶解分子的主要来源，CD8+ T细胞中衰竭标记的少量表达表明了LN中的细胞毒性。浸润白细胞的干扰素反应特征与血液中的相同特征相关，趋化因子受体CXCR4和CX3CR1在肾脏免疫细胞中频繁表达，提示它们可能是潜在的治疗靶点，尿液免疫细胞基因表达与相应的肾脏白细胞高度相关。
参考文献 ：
[1] Arazi A., Rao, D. A., et al. (2019). The immune cell landscape in kidneys of patients with lupus nephritis. Nature Immunology.
