传统的高通量测序是对某一组织整体的细胞合集进行测序和分析，而某一个细胞的基因信息则会被整体覆盖。2009年首个单细胞转录组测序技术问世，开启了单细胞组学时代，在2013年单细胞测序技术被Nature Methods评为年度技术。单细胞测序技术经过十余年发展，各类单细胞测序技术平台也如雨后春笋般出现，极大地推动生物医学领域的相关研究，帮助科研人员克服了稀有生物样本以及生物样本内生异质性等重大挑战。
DNBelab C4 基于液滴微流控原理，实现单细胞的捕获和标记，使用DNBSEQ建库技术构建专有文库，采用DNBSEQ T7系统获得测序数据，并使用配套的分析软件进行数据分析与可视化，在单细胞层面进行基因表达、细胞注释和异质化研究。
1、测序策略
测序策略：PE100
测序深度：推荐平均50k reads/cell
测序数据量：100~120G/样本
2、送样建议
（1）细胞：大于1*106个细胞；
（2）组织解离的细胞：大于1*106个细胞；
（3）血液：大于3 mL；
（4）PBMC：大于1*106个细胞；
（5）组织：大于黄豆粒大小；
（6）细胞活性大于80%。
3、技术优势
（1）便携，操作简单：重量220g，无需电源，负压驱动的液滴生成系统，有效地简化液滴捕获过程。
（2）双磁珠高效捕获：采用自主设计的捕获磁珠，有效提高细胞捕获效率以及获取下拨的完整信息。
（3）低双胞率，基因检测能力更稳定：双胞率低于8%，每个细胞平均基因数在1000~2000。
（4）数据高保真，性价比高：搭配国产超高通量DNBseq-T7测序平台，既保证测序数据准确性，也降低测序成本。
4、数据分析
4.1 标准信息分析
（1）测序数据统计与评估
a. 各个样本测序数据基本质控（reads数、测序饱和度等）
b. 各个样本数据比对（细胞数目统计、reads基因组比对率等）
c. 多样本数据合并（基因表达定量）
（2）单细胞亚群分类与分类结果可视化
a. 细胞过滤
b. 单细胞亚群分类（各亚群单个细胞基因中位数、各样本在各亚群数目统计）
c. 分类结果可视化（聚类分析可视化（tSNE图））
（3）亚群上调表达基因分析
a. 上调表达基因筛选
b. 上调表达基因基因GO功能富集分析
c. 上调表达基因KEGG功能富集分析
（4）标记基因筛选
a. 标记基因筛选（标记基因在各亚群平均表达量、标记基因聚类热图）
b. 各标记基因在群体中的表达分布（标记基因tSNE图）
4.2 高级分析
（1）已知表达基因（分子markers或表面标记物）在各亚群表达分布图及热图（甲方提供基因标准名称）
（2）细胞轨迹分析
（3）加权基因共表达网络（WGCNA）
（4）差异表达基因TF编码能力预测
（5）差异表达基因蛋白互作分析
（6）基因相关性网络分析
（7）细胞周期鉴定分析
5、技术流程
6、案例分析
案例（1） 非人灵长类动物食蟹猴的单细胞转录组图谱
研究团队对食蟹猴45个组织约114万个细胞进行单细胞测序分析，获得非人灵长类动物全身器官细胞图谱（图1）。基于该图谱构建了126种病毒易感细胞类型的病毒数据库，可以通过它快速查询病毒最有可能侵染的细胞类型，同时看到该细胞类型可能分布的器官。该图谱还可用于物种进化、人类疾病以及药物评价和筛选相关的研究，为生物医学的发展提供基础性的资源和工具，为疾病诊疗、靶向药物开发提供助力，为人类更好地探究生命的进化提供可能。
图1 食蟹猴全身器官图谱
案例（2） 人类多能性干细胞转化为8细胞阶段全能性胚胎样细胞
研究团队通过系统性的筛选，首次建立了体外全能性的8细胞期胚胎样细胞（8CLC）的诱导和富集方法。基于DNBelab C4平台，对8CLC诱导过程的细胞样本进行了单细胞转录组（scRNA-seq）和染色质可及性（scATAC-seq）测序，详细分析了8CLC群体的特征，并在多个诱导时间点描绘了8CLC群体的特征，并在多个诱导时间点描绘了8CLC诱导过程中转录组和染色质开放性的动态变化，为研究人类8细胞期的合子基因组激活和发育调控提供了重要的平台和资源，将拓展我们对人类早期胚胎发育的有限认知。
案例2 图1 人胚胎干细胞图谱
参考文献：
[1]Han L，et al. Cell transcriptomic atlas of the non-human primateMacaca fascicularis[J]. Nature，2022
[2]Mazid, M.A., et al.Rolling back of human pluripotent stem cells to an 8-cell embryo-like stage[J]. Nature，2022
